一、目的

学习和掌握筛选营养缺陷型突变株的原理及方法。

二、原理

营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，因而必须在基本培养基中补加该营养物质才能正常生长的一类突变菌株。由于减低或消除了末端产物浓度，可解除反馈代谢调控，使代谢途径中间产物或分枝合成途径中末端产物得以积累。所以营养缺陷型菌株被广泛用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中，也广泛用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记。

三、材料

1.菌种聽 枯草杆菌（B.subtilis）。
2.培养基

(1)细菌完全培养基(CM)。
(2)细基本培养基（MM）

(3)无氮基本培养基（基本培养棊中不加(NH₄)SO₄和琼脂）。

(4)2倍氮源基本培养基〔基本培养基中加入2倍(NH₄)SO₄，不加琼脂〕

(5)限制培养基（SM）（液体基本培养基中加入0.1%~0.5%的完全培养基和2%琼脂）。
3.溶液

(1)无维生素的酪素水解物或氮基酸混合液。
(2)水溶性维生索混合液。 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽

(3)核酸（RNA）水解液聽 制作法：取2_gRNA，加入15ml 1mol/L NaOH; 另取2_gRNA,加入15ml 1mol/L HCL，分別于100℃水浴加热水解20min后混合，调整pH为6.0,过滤后调整体积为40ml。

4.设备及器皿聽 诱变箱、离心机、直径90mm培养皿，250ml三角瓶。

四、方法与步骤

1.出发菌株聽 取新活化的枯草杆菌斜面菌种1环，加人装有20ml完全培养基的
250ml三角瓶中， 30℃振荡培养16~18h，取1ml培养液转接于另一只装有20ml完全培养基的250ml三角瓶中， 30℃振荡培养6h，使细胞处于对数生长状态。
2.细胞悬液的制备

（1）取10ml培养液，离心3500r/min,10min)收集菌体，用生理盐水离心洗涤2
次，而后将菌体充分悬浮于11ml生理盐水中，调整细胞浓度为10⁸个/ml。

（2）以活菌计数法测定细胞悬液浓度。

3.诱变处理聽 取10ml处理菌液于直径90mm培养皿中（带磁棒〉，用紫外线照射60s 。4.中间培养聽 取1ml处理菌液转人裝有20ml液体完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养过夜。

五、淘汰野生型(青霉素法〉

（1）取10ml中间培养液，离心（3500r/min,10min）收集菌体，用生理盐水离心洗涤2次，之后将菌体转入10ml无氮基本培养基中，30℃振荡培养6~8h（饥饿培养）。

（2）将全部菌液转入10ml 2倍氮源基本培养中，30℃振荡培养1銆淈/span>2h加入终浓度为
100u/ml的青霉素（母液浓度为2000u/ml）继续培养5銆淈/span>6h杀死野生型细胞，浓缩缺陷型细胞。

（3）取10ml菌液，离心收集菌体，用生理盐水离心洗涤-次，而后将菌体充分悬浮于10ml生理盐水中。

六、营养缺陷型菌株的检出（逐个检出法〉

（1）取0.1ml菌悬液，涂布于限制培养基平板上|（3个平板以上〕，30℃培养48h,野生型形成大菌落，缺陷型为小菌落。

（2）制备完全培养基和基本培养基平板各4个，并在皿的背面划好方格〔毎皿以30个格左右为好〕

（3）用牙签从限制培养基平板上逐个挑取小菌落，对应点接在基本培养基平板和完全
培养基平板上（先点接似MM平板，后点接CM平板）。30℃培养48h将在完全培养基平板生长，而在基本培养基平板上相对应位置上不生长的菌落，接入完全培养基斜面，30℃培养24h作为营养缺陷型鉴定用菌株。

七、营养缺陷型菌株的鉴定

（1）取待测菌株斜面1环接于5ml生理盐水中，充分混匀，离心收集菌体，然后，将菌体充分悬浮于5ml生理盐水中。

（2）取1ml菌悬液与平皿中，倾入约15ml融化并冷却至45~50℃的基本培养基，制成待测平板。

（3）将待测平板背面划分成3个区域，在平板表面3个区域分别贴上蘸有氨基酸混合液，维生素混合液，核酸水解液的滤纸片，30℃培养24h。观察滤纸片周围菌落生长情况。在滤纸片周围生长的菌株，即为相应的营养缺陷型菌株。

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