聽

2聽聽 病毒的超低温保存法聽

聽

2.1聽聽 一般概念聽

聽

聽聽聽聽聽聽聽聽 大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。 需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真 菌） ，通常可用超低温的方法保存（ATCC聽 1983；Halliday，Baker聽 1985） 。

聽聽聽聽聽聽聽 此法是将冻存 在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管 贮存在—150～－196℃的液氮中。 超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油（10％） 、二甲亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入 37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存 的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。聽

聽

2.2聽聽聽 材料聽

聽

病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex） ，液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。聽

聽

2.3聽聽 方法聽

聽

（1）剪一段两端各超出冷冻管长度 2cm 的热收缩塑料管。聽

（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将 0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。聽

（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。聽

（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。聽

（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。聽

（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套） 。聽

（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。聽

（8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入 37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。聽

聽

3聽聽聽 低温保存法聽

聽

3.1聽聽 材料聽

聽

（1）培养基：聽

2 号营养肉汤粉（Unipath）聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 2.5g聽

甘油（Sigma）聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 15ml聽

蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽 85ml聽

将上述材料混匀后，分装在 5ml 瓶内，在 121℃下灭菌 15 分钟。聽

（2）厌氧菌用 BGP 培养基〔其中不加琼脂，而加 15％（体积比）甘油〕 ：聽

胰蛋白胨（Unipath）聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 1.0g聽

氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽聽聽 0.5g聽

牛肉提取物聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽聽聽聽聽 0.3g聽

酵母提取物聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 0.5g聽

盐酸半胱氨酸聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽聽聽聽聽聽 0.04g聽

葡萄糖聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽0.1g聽

磷酸氢二钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 0.4g聽聽聽

甘油聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽聽聽聽 15ml聽

蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽聽 85ml聽

将上述材料混匀后，分装在 10ml 瓶内，在 121℃下消毒 15 分钟。以上两种培养基使用前均能在 4℃环境中存放几个月。聽

（3）玻璃珠：将直径为 2mm 的玻璃珠（Creative聽 Beadcraft聽 Ltd；mersham，Buckinghamshire，UK）按上述冻干法中的清洗法清洗。聽

（4）冷冻管：在 2ml有盖冷冻管（Nunc，Paisley，Scotland）内存放 20～30 粒清洗好的玻璃珠，盖好盖后置 121℃下消毒 15 分钟。消毒过的冷冻管可在室温下保存。聽

聽聽聽聽聽聽聽 此外，将超低温冰箱预先冷却到—70℃，灭菌塑料加样头。聽

聽

3.2聽聽 方法聽

聽

（1）用非选择性固体培养基（如营养琼脂或血琼脂）在适宜细菌生长的条件下培养细菌。聽

（2）无菌条件下加 2ml 细菌悬浮液至营养肉汤中。聽

（3）用一支无菌的塑料环将细菌和肉汤混匀（细菌的最终浓度为 108～1010 个细胞／ml） 。聽

（4）按冻干法在无菌条件下将细菌分装到有灭菌玻璃珠的冷冻管内，反复吹打几次，使珠子内部的气泡完全被细菌悬浮液所替代。聽

（5）吸去冷冻管内多余的液体。聽

（6）将混有细菌和珠子的冷冻管放在架子（Jencons Scientific Ltd，Leighton，Buzzard，Bedfordshire，UK）上，然后将架子放入—70℃的冰柜内。聽

（7）从冰柜中取出一支冷冻管，在无菌条件下打开，用灭菌镊子从管中取出一粒珠子，然后迅速将管子放回冰柜，以免管子内的其余珠子融解。聽

（8）直接将珠子接种到固体培养基上或液体培养基中，在适当的条件下培养。聽

聽