一. 目的

植物病毒中,绝大多数核酸为RNA,为研究病毒核酸组分结构及功能,首先要将病毒的核酸分离、提取。本实验即学习用酚-SDS法提取病毒RNA.

二.实验材料

聽聽聽聽 纯化TMV、CMV或其它病毒等.

三.实验用仪器及药剂

聽聽聽聽 高速离心机，真空干燥仪，微量取样器，1.5mL离心管
聽聽聽聽 抽取缓冲液(20mMTris-HClpH8.0；1%SDS；200mMNaCl，5mMEDTA)
聽聽聽聽 饱和苯酚/氯仿(1聽 ∶1)，氯仿/异戊醇(24聽 ∶1)，预冷100%和70%的乙醇，DEPC处理后灭菌蒸馏水。

四.实验步骤

聽聽1.取适量病毒提纯液20～100μl,加灭菌蒸馏水至200 μl
聽 2.加入等体积(200 μl)抽提缓冲液
聽 3.加等体积饱和苯酚/氯仿(400 μl)，轻微振荡混合2-5分钟
聽 4.12000rpm离心2分钟
聽 5.取上清水相，再加等体积饱和苯酚/氯仿，混合抽提
聽 6.12000rpm离心2分钟
聽 7.加等体积氯仿/异戊醇(24聽 ∶1)抽提一次
聽 8.取上清水相加2.5倍体积无水冷乙醇，混匀、置-20℃下2小时
聽 9.12000rpm离心15分钟聽
聽聽10.倒去乙醇,沉淀用70%冷乙醇(0.5ml)洗涤2次聽
聽聽11.真空干燥,3～5分钟聽
聽聽12.沉淀溶于20 μl灭菌蒸馏水中,-20℃保存聽
聽聽13.取5 μl病毒RNA稀释到1ml,测O.D260，计算5 μl里RNA含量。

核酸、蛋白、病毒的浓度:

聽聽聽 1.核酸溶液:
聽聽聽聽聽 双链RNA或DNAO.D260 ≌1时为50 μg/ml(微克/毫升)
聽聽聽聽聽 单链RNA或DNAO.D260 ≌1.3时为50 μg/ml
聽聽聽聽聽 双链DNA浓度=[(G+(摩尔数)+14.19]/8.63≌1.7克/毫升
聽聽聽聽聽 RNA密度≌1.9g/ml

聽聽聽 2.蛋白质溶液:
聽聽聽聽聽 O.D280 ≌1.0时为1mg/ml
聽聽聽聽聽 含有核酸的蛋白质,其浓度(mg/ml)=1.5O.D280 －0.75O.D260　　　

聽聽聽 3.病毒:
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 0.1%
聽聽聽聽 病毒浓度(mg/ml)=O.D260 ×稀释倍数/E1cm聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 260nm
聽聽聽聽 病毒产量(mg/kg)=病毒浓度×提纯总ml数×1000/组织重(g)

聽

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