1聽范围

本标准规定了食品中大肠菌群（聽Coliforms）计数的方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的计数。

2聽术语和定义

2.1聽大肠菌群聽coliforms聽
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2聽最可能数聽most聽probable聽number，MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法。

3聽检验原理

3.1聽聽MPN法

MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

3.2聽平板计数法

大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。
4聽设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
4.1聽恒温培养箱：聽36聽℃聽±1聽℃。
4.2聽冰箱：聽2聽℃～5聽℃聽。
4.3聽恒温水浴箱：聽46℃±1℃聽。
4.4聽天平：感量聽0.1聽g。
4.5聽均质器。
4.6聽振荡器。
4.7聽无菌吸管：聽1聽mL（具聽0.01聽mL聽刻度）、聽10聽mL（具聽0.1聽mL聽刻度）或微量移液器及吸头。
4.8聽无菌锥形瓶：容量聽500聽mL。
4.9聽无菌培养皿：直径聽90聽mm。
4.10聽pH聽计或聽pH聽比色管或精密聽pH聽试纸。
4.11聽菌落计数器。
5聽培养基和试剂

5.1聽月桂基硫酸盐胰蛋白胨（聽Lauryl聽Sulfate聽Tryptose，聽LST）肉汤：见附录聽A聽中聽A.1。
5.2聽煌绿乳糖胆盐（聽Brilliant聽Green聽Lactose聽Bile，聽BGLB）肉汤：见附录聽A聽中聽A.2。
5.3聽结晶紫中性红胆盐琼脂（聽Violet聽Red聽Bile聽Agar，聽VRBA）：见附录聽A聽中聽A.3。
5.4聽磷酸盐缓冲液：见附录聽A聽中聽A.4。
5.5聽无菌生理盐水：见附录聽A聽中聽A.5。
5.6聽无菌聽1聽mol/L聽NaOH：见附录聽A聽中聽A.6。
5.7聽无菌聽1聽mol/L聽HCl：见附录聽A聽中聽A.7。

第一法聽大肠菌群聽MPN聽计数法

6聽检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1聽。

图1聽大肠菌群聽MPN聽计数法检验程序

7聽操作步骤
7.1聽样品的稀释
7.1.1聽固体和半固体样品：称取聽25聽g聽样品,放入盛有聽225聽mL聽磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内聽,8000聽r/min～10000聽r/min聽均质聽1聽min～2聽min,或放入盛有聽225聽mL聽磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器以6次/s～9次/s拍打聽1聽min～2聽min，制成聽1:10聽的样品匀液。
7.1.2聽液体样品：以无菌吸管吸取聽25聽mL聽样品置盛有聽225聽mL聽磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成聽1:10聽的样品匀液。
7.1.3聽样品匀液的聽pH聽值应在聽6.5～7.5聽之间，必要时分别用聽1聽mol/L聽NaOH聽或聽1聽mol/L聽HCl聽调节。

7.1.4聽用聽1聽mL聽无菌吸管或微量移液器吸取聽1:10聽样品匀液聽1聽mL，沿管壁缓缓注入聽9聽mL聽磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用聽1聽支聽1聽mL聽无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成聽1:100聽的样品匀液。
7.1.5聽根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1聽次，换用聽1聽支1聽mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15聽min。
7.2聽初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3
管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（聽LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1聽mL，则用双料LST肉汤），聽36℃聽±1聽℃培养24聽h±2聽h，观察倒管内是否有气泡产生，聽24聽h±2聽h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48聽h±2聽h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
7.3聽复发酵试验（证实试验）
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1聽环，聽移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（聽BGLB）聽管中，聽36聽℃聽±1℃培养48聽h±2聽h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

7.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按7.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的

MPN值。

第二法聽大肠菌群平板计数法

8聽检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

图2聽大肠菌群平板计数法检验程序

9聽操作步骤

9.1聽样品的稀释
按7.1进行。
9.2聽平板计数
9.2.1聽选取2个～3个适宜的连续稀释度,聽每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1聽mL。同时取1聽mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
9.2.2聽及时将15聽mL～20聽mL冷至46聽℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（聽VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3聽mL～4聽mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36聽℃聽±1聽℃培养18聽h～24聽h。
8.3聽平板菌落数的选择
选取菌落数在聽15聽CFU～150聽CFU聽之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为聽0.5聽mm聽或更大。

9.4聽证实试验
从聽VRBA聽平板上挑取聽10聽个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于聽BGLB聽肉汤管内，聽36聽℃聽±1聽℃培养聽24聽h～48聽h，观察产气情况。凡聽BGLB聽肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。聽
9.5聽大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g
（聽mL）样品中大肠菌群数。例：聽10-4样品稀释液1聽mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：聽100×6/10×104/g（聽mL）=6.0×105CFU/g（聽mL）。

附聽聽录A
培养基和试剂

A.1聽月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤
A.1.1聽成分
胰蛋白胨或胰酪胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽20.0聽g
氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0聽g
乳糖聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0聽g
磷酸氢二钾（K2HPO4）聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.75聽g
磷酸二氢钾（聽KH2PO4）聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.75聽g
月桂基硫酸钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.1聽g
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1聽000聽mL
pH聽6.8±0.2
A.1.2聽制法
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节聽pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管聽10聽mL。聽121聽℃高压灭菌聽15聽min。
A.2聽煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤
A.2.1聽成分
蛋白胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10.0聽g
乳糖聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10.0聽g
牛胆粉（聽oxgall或oxbile）溶液聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽200聽mL
0.1%煌绿水溶液聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽13.3聽mL
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽800聽mL
pH聽7.2±0.1
A.2.2聽制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500聽mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200聽mL（将20.0聽g脱水牛胆粉溶于200聽mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975聽mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3聽mL，用蒸馏水补足到1聽000聽mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10聽mL。聽121聽℃高压灭菌15聽min。
A.3聽结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
A.3.1聽成分
蛋白胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽7.0聽g
酵母膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽3.0聽g
乳糖聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10.0聽g
氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0聽g
胆盐或3号胆盐聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1.5聽g
中性红聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.03聽g
结晶紫聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.002聽g
琼脂聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽15聽g～18聽g
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1聽000聽mL
pH聽7.4±0.1

A.3.2聽制法
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2聽min，将培养基冷却至45聽℃～
50聽℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3聽h。
A.4聽磷酸盐缓冲液
A.4.1聽成分
磷酸二氢钾（聽KH2PO4）聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽34.0聽g
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽500聽mL
pH聽7.2
A.4.2聽制法
贮存液：称取34.0聽g的磷酸二氢钾溶于500聽mL蒸馏水中，用大约175聽mL的1聽mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1聽000聽mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25聽mL，用蒸馏水稀释至1聽000聽mL，分装于适宜容器中，聽121聽℃高压灭菌15聽min。
A.5聽无菌生理盐水
A.5.1聽成分
氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽8.5聽g
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1000聽mL
A.5.2聽制法
称取8.5ｇ氯化钠溶于1000聽mL蒸馏水中，聽121聽℃高压灭菌15聽min。
A.6聽1聽mol/L聽NaOH
A.6.1聽成分
NaOH聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽40.0聽g
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1000聽mL
A.6.2聽制法
称取40聽g氢氧化钠溶于1000聽mL蒸馏水中，聽121聽℃高压灭菌15聽min。
A.7聽1聽mol/L聽HCl
A.7.1聽成分
HCl聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽90聽mL
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1000聽mL
A.7.2聽制法
移取浓盐酸90聽mL，用蒸馏水稀释至1000聽mL，聽121聽℃高压灭菌15聽min。

附聽聽录B

大肠菌群最可能数（MPN）检索表

聽聽聽B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表

每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表B.1。

表B.1聽聽大肠菌群最可能数（MPN）检索表

聽

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